구매자 가이드 PCR 기술

중합효소연쇄반응(PCR) 기술은 생물의학, 임상 진단, 식품 미생물학 테스트 및 범죄 법의학을 포함한 다양한 분야의 수많은 연구 및 테스트 실험실의 필수 요소입니다.이 기본 기술은 열 순환을 사용하여 DNA 샘플이 신속하고 기하급수적으로 복제되어 수백만 또는 수십억 개의 서열 사본을 생성하는 일련의 반응을 촉진합니다.새로운 PCR 시스템을 구입할 때 애플리케이션의 최종 목표, 열 사이클링 장비의 정확성과 효율성, 기기의 용량과 유연성을 고려하는 것이 중요합니다.이 문서에서는 귀하의 응용 분야에 적합한 시스템을 찾는 데 도움이 되도록 PCR 시스템에 사용할 수 있는 다양한 옵션과 기능에 대한 개요를 제공합니다.

1. PCR vs. qPCR vs. dPCR

모든 PCR 시스템은 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 DNA를 복제하지만 특정 결과를 얻기 위해 시스템마다 사용하는 방법도 다릅니다.이러한 다양한 방법 중에는 표준 PCR, 정량적 PCR(qPCR) 및 디지털 PCR(dPCR)이 있습니다.

표준 PCR 기계는 일반적으로 추가 다운스트림 테스트 및 사용을 위해 DNA를 증폭하는 데 사용됩니다.어떤 의미에서 이 기술은 분석 테스트 방법 자체보다는 최종 제품을 생성하는 수단으로 사용됩니다.증폭된 DNA는 실시간이 아닌 PCR 반응이 완료된 후에야 측정이 가능하므로 이 방법을 end-point PCR이라고도 합니다.전통적인 PCR 증폭의 최종 산물은 일반적으로 다운스트림 클로닝 및 시퀀싱에 사용되며 겔 전기영동을 사용하여 낮은 분해능(밴드 강도 기준)에서 표적 서열의 존재 및 상대적 수량을 확인할 수도 있습니다.

시료에 존재하는 표적 서열의 양을 보다 빠르고 정확하게 정량화하기 위해 실시간 PCR이라고도 알려진 정량적 PCR(qPCR)은 증폭 과정에서 형광 프로브를 사용하여 각 열 주기 후에 존재하는 DNA의 양을 모니터링합니다.형광 강도의 특정 임계값을 충족하는 데 필요한 사이클 수를 관찰함으로써 분석가는 결과를 표준 곡선과 비교할 때 출발 물질의 DNA 양을 결정할 수 있습니다.qPCR은 또한 end-point PCR보다 더 빠르게 표적 서열의 유무를 확인할 수 있으므로 SARS-CoV-2 검출(역전사를 사용하여 먼저 바이러스 RNA를 cDNA로 변환)과 같은 진단 응용 분야에 사용됩니다.

디지털 PCR(dPCR)은 PCR 반응이 수천 개의 별도 반응 챔버에서 일어나는 또 다른 정량 방법이며, 증폭이 완료된 후 형광 신호를 생성하는 반응 챔버 수에 따라 원래 샘플의 DNA 분자의 절대 수를 결정할 수 있습니다. .qPCR과 달리 형광 측정은 실시간으로 수행되지 않으며 샘플의 DNA를 정량화하는 데 표준 곡선이 필요하지 않습니다.dPCR은 일반적으로 qPCR보다 처리량이 제한적이고 비용이 높지만 DNA 정량에 있어서 더 정밀하고 민감하며 정확하며 희귀 돌연변이 및 단일 염기 다형성(SNP) 검출과 같은 응용 분야에 특히 유용합니다.

응용 분야를 고려할 때 종점(정성/반정량) PCR과 정량(qPCR 또는 dPCR) 방법 중 무엇을 선택할지 결정하는 것은 상대적으로 간단하지만, qPCR과 dPCR 중 선택은 좀 더 미묘한 차이가 있을 수 있습니다.qPCR은 처리량이 많고 비용 효율적이며 많은 응용 분야에 충분히 민감하지만 검출 한계가 낮은 절대 정량화가 중요한 경우 dPCR이 더 나은 선택일 수 있습니다.

2. 온도 조절의 중요성

시료의 온도를 정확하고 효율적으로 조정하고 제어하는 ​​열 순환기의 능력은 증폭 반응의 성공을 가능하게 하며 모든 PCR 시스템 선택 시 중심 초점이 되어야 합니다.다양한 시스템은 램프 속도, 온도 균일성 및 정확성, PCR 방법 최적화를 지원하기 위해 열 블록 전반에 걸쳐 온도 구배를 달성하는 기능과 관련하여 다양한 기능을 제공할 수 있습니다.

램프 속도는 열 순환 단계 사이의 온도 변화 속도를 나타내며 일반적으로 기기 사양에서 초당 섭씨 온도(°C/초)로 표시됩니다.제조업체는 최대 램프 속도와 평균 램프 속도에 대한 정보를 제공할 뿐만 아니라 기기의 램프 속도 상승(가열)과 하강 램프 속도(냉각)를 구별할 수도 있습니다.일반적으로 램프 속도가 높을수록 런타임이 빨라지지만 구매자는 계측기 속도와 관련된 다른 지표를 검토하지 않고 최대 램프 속도에 초점을 맞추는 것에 대해 주의해야 합니다.계측기는 짧은 시간 동안만 최고 램프 속도를 달성할 수 있으며 평균 램프 속도는 온도 변화 속도를 더 잘 반영합니다.램프 속도 사양은 특정 계측기가 얼마나 빨리 실행될 수 있는지에 대한 일반적인 아이디어를 제공할 수 있지만, 가능한 경우 계측기에서 시연된 실제 런타임에 대한 데이터를 찾아 높은 램프 속도가 빠른 분석으로 변환되는 방식에 대한 현실적인 그림을 얻습니다.

온도 정확성과 균일성 또한 성공적인 반응의 핵심입니다. 모든 열 순환기는 PCR에 필요한 온도를 생성하도록 설계되었지만 특정 기능은 더 높은 수준의 신뢰도를 제공할 수 있습니다. 이는 샘플이 제한될 수 있고 신뢰할 수 있는 결과가 필요한 응용 분야에 매우 중요합니다. 임상 진단 및 법의학에서 가장 중요합니다.고분해능 용융(HRM) 분석과 같은 민감한 기술을 위해 PCR 기계를 사용할 때 정밀한 온도 제어도 중요합니다.가열된 뚜껑은 PCR 튜브 전체에 걸쳐 더 나은 온도 균일성을 보장할 수 있습니다. 가열된 뚜껑이 없으면 샘플이 증발하여 온도가 더 낮은 튜브 상단으로 응축될 수 있기 때문입니다.열 블록 설계는 온도 제어에도 영향을 미칩니다.알루미늄 블록은 가장 경제적인 옵션이지만 전도성이 가장 낮습니다. 즉, 전도성이 높은 블록보다 온도 균일성을 더 느리게 달성하고 램프 속도가 더 낮습니다.은 및 금 코팅 블록은 가격이 더 비싸지만 열 전달이 더 빠르게 일어나 블록 전체에 균일한 온도 분포가 보장됩니다.

DNA 표적마다 최상의 증폭 결과를 얻기 위해서는 다양한 온도가 필요할 수 있습니다.예를 들어, GC가 풍부한 시퀀스는 변성을 위해 더 높은 온도가 필요합니다.이상적인 어닐링 온도는 다양한 요인의 영향을 받습니다. 이 단계의 온도는 일반적으로 프라이머의 용융 온도, 프라이머 쌍 간의 용융 온도 차이, 시약 농도, pH 및 염 농도의 영향을 기반으로 선택됩니다. 반응 온도 조건을 최적화하는 것은 복잡한 작업입니다. 온도 구배 기능을 갖춘 PCR 기계는 단일 실행에서 여러 어닐링 온도를 테스트할 수 있도록 하여 PCR 방법의 최적화를 지원하도록 설계되었습니다.PCR 기계를 사용하여 분석하려는 샘플의 유형과 다양성에 따라 기울기 기능이 있는 기기를 선택하는 것은 상당한 시간을 절약하고 더 적은 실행으로 새로운 프로토콜을 최적화하는 시약을 절약하기 위해 추가 비용을 지불할 가치가 있을 수 있습니다.

3. 열 블록

앞서 언급한 대로 PCR 기기와 함께 사용되는 열 블록은 온도 제어에 차이를 만들 수 있지만, 블록 설계와 다양한 블록을 수용하는 기기 설계도 처리량, 소모품 비용 및 유연성에 영향을 미칩니다.일반적인 블록은 96웰 또는 384웰 형식으로 제공되지만 48웰 및 1536웰과 같은 다른 형식도 사용할 수 있습니다.웰 수가 많을수록 더 적은 반응량으로 더 높은 처리량이 가능해 처음에는 비용이 더 많이 들지만 궁극적으로 각 웰에 사용되는 시약의 양이 적기 때문에 반응당 가격이 낮아집니다.처리할 샘플 수와 기계 사용 빈도를 고려하면 웰 수가 더 적거나 많은 열 블록이 실험실에서 가장 실용적이고 비용 효율적인지 여부가 결정됩니다.

일부 장비는 고정 블록 형식으로 제공되는 반면 다른 장비는 교체 가능한 블록을 사용할 수 있도록 하여 96웰과 384웰 형식 간 또는 다양한 응용 분야에 맞는 다양한 블록 재료 간 전환이 가능한 유연성을 제공합니다.일부 열 순환기는 동일한 장비에 여러 블록을 수용하여 동시에 다양한 샘플 세트에서 다양한 프로토콜을 실행할 수 있습니다.3 '범용' 크기의 블록은 다양한 크기의 튜브, 스트립 또는 PCR 플레이트를 사용할 수 있는 유연성을 더욱 향상시킵니다. 필요에 따라.

온도 제어, 시료 처리 및 처리량에서 이 구성 요소의 핵심 역할로 인해 Thermal Cycler를 선택할 때 열 차단 옵션을 신중하게 고려해야 합니다.샘플량이 적은 실험실이나 정기적으로 소수의 분석만 실행하는 실험실의 경우 표준 96웰 형식의 저렴한 고정 블록 기기로 충분할 수 있습니다.그러나 모듈식의 유연한 기기는 더 많은 수의 프로토콜, 다양한 시료량, 자체 분석을 위해 동일한 기기를 사용하는 더 많은 사용자가 있는 실험실뿐만 아니라 향후 처리량 용량을 확장하려는 실험실에도 유리할 수 있습니다.