현재의 핵산 추출 방법

현재의 핵산 추출 방법

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핵산 추출(NAE)은 분자 생물학의 가장 중추적인 단계 중 하나이며 생물학 및 의학의 여러 분야에서 일상적으로 사용됩니다. 이 절차는 모든 분자 진단 키트의 출발점이 되기 때문입니다[1].이 중요한 절차는 한 세기 넘게 알려져 왔으며 지난 수십 년 동안 상당히 발전했습니다.그러나 NAE 프로토콜이 실험실 설정을 현장 진단(POC-Dx)의 '실제 세계'로 이동시키려면 여전히 일부 진전이 이루어져야 합니다.

요즘에는 세포 내 핵산(NA)이 게놈(또는 염색체), 플라스미드 및 다양한 유형의 RNA로 광범위하게 분류될 수 있는 것으로 알려져 있습니다.RNA는 우라실을 가지고 있고 DNA는 티민을 가지고 있지만, 핵산은 유사한 기본적인 생화학적 특성을 나타내지만 아주 뚜렷한 3차원 구조(게놈, 플라스미드, tRNA, mRNA, rRNA 등)를 가질 수 있습니다.그러나 구조적 차이에도 불구하고 이 본문에 설명된 가장 일반적으로 사용되는 방법은 RNA 및 다차원 형식(mRNA, rRNA, tRNA)뿐만 아니라 다양한 조직 형식(염색체, 플라스미드 등)의 DNA에 적용될 수 있습니다. , miRNA 등)을 약간 수정했습니다.

NAE는 대략 4단계로 나눌 수 있으며, 이는 샘플 및 다운스트림 응용 분야에 따라 조절될 수 있습니다. (i) 세포 파괴;(ii) 막 지질, 단백질 및 기타 핵산 제거, (iii) 벌크에서 핵산 정제/결합;및 (iv) 핵산 농도.

세포 파괴 또는 분해는 물리적 및/또는 화학적 방법으로 달성할 수 있으며, 그 주요 목적은 세포벽 및/또는 세포막을 파괴하는 것입니다.파괴 방법은 주로 시료의 특성을 기반으로 하며 이 목적을 위해 광범위한 도구와 접근법을 단독으로 사용하거나 결합하여 조직/세포 파괴를 달성합니다.용해 효소, 카오트로픽제 및 다양한 유형의 세제가 화학적 용해의 주요 구성 요소인 반면, 기계적 방법은 분쇄, 전단, 비드 박동 및 충격을 통해 세포를 파괴합니다.한 기술이 좋은 결과를 내지 못한다면 다른 기술이 성공할 수도 있다는 점은 흥미롭습니다.삼투 충격 방법은 어떤 경우에는 페놀-클로로포름 추출 및 비드 박동과 같은 일반적인 NA 정제 프로토콜보다 더 나은 결과를 가져왔습니다.세포 파괴는 DNA 추출에 중요할 뿐만 아니라, 이 과정을 통해 많은 재조합 단백질과 세포의 기타 중요한 구성 요소를 회수할 수 있기 때문에 바이오 제약 산업에서도 중요한 역할을 합니다.세포 파괴를 위한 또 다른 접근법은 다양한 방법을 조합하여 사용하는 것입니다.좋은 예는 보호 단백질 비계에서 NA를 제거하기 위해 프로테아제를 사용하는 많은 프로토콜이 있는 효소 용해의 경우입니다.또한, 새로운 단백질이 없는 NA를 보호하기 위해 용액으로 자유롭게 나오는 세포 뉴클레아제의 불활성화는 중요합니다.단일 용액에 세제와 카오트로픽 염을 조합하여 세포벽 및/또는 세포막을 용해시키고 세포내 뉴클레아제를 비활성화하는 데 사용됩니다.반면에 기계적 파괴는 힘을 사용하여 세포의 구성 요소를 추출합니다.생명과학 분야에서 분쇄의 전형적인 예는 막자사발과 막자사발을 사용하는 것인데, 이는 요즘 액체 질소(시료에서 허용되는 경우)를 사용하여 최적화됩니다.세포벽은 초음파 처리나 캐비테이션에 의해 유발되는 압력의 급격한 변화에 의해 생성되는 충격파에 의해 파괴될 수도 있습니다.세포 파괴에 사용할 수 있는 다른 기계적 도구로는 접선 힘을 사용하여 세포에 구멍을 만드는 전단 및 앞서 언급한 것처럼 다른 유리 또는 강철 구슬을 사용하여 단단한 세포벽을 파열하는 비드 비팅이 있습니다..

NAE 방법은 DNA와 RNA 모두의 추출을 포함하지만 화학적으로 구동되는 방법이나 고체상 방법으로 더 광범위하게 특성화될 수 있습니다.두 가지 모두 위에서 언급한 네 가지 단계를 포함합니다.다음 섹션에서는 현재 생물학 및 의학에서 사용되는 주요 방법의 작동 원리 및/또는 이론적 근거를 검토할 것입니다.분자 진단은 NAE로 시작하는 기술에 크게 의존하므로 POC-Dx에 사용할 수 있는 장치의 기본 기능 중 일부에 대해서도 논의하고 NAE 방법을 현장 진단 테스트에 적용하는 데 따른 과제와 한계에 대해 논의할 것입니다.